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外周血單個核細胞(PBMC)制備方法及注意事項

發布時間:2021-03-01      點擊次數:2176

外周血單個核細胞(PBMC)制備方法及注意事項

外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有單個核的細胞,包括淋巴細胞(Lymphocyte)、單核細胞(Monocyte)、樹突狀細胞(DC)和其他少量細胞。PBMC可利用健康人或動物供體的外周血,通過Ficoll密度梯度離心,磁珠分選等步驟獲得,主要包括淋巴細胞和單核細胞。

Ficoll是蔗糖的多聚體,中性,平均分子量400,000,當密度為1.2g/mL,未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大,離心后沉于管底;淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重,離心后漂浮于分層液的液面上,也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞,就可從外周血中分離到單個核細胞。
 
人PBMC中不同細胞類型的比例
PBMC中大部分都是淋巴細胞,包括B細胞和T細胞,其中CD3+T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。這些T細胞都處于初始(naive)狀態,即已經成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中,只有非常小的一部分初始T細胞會因抗原識別而被激活。同樣的B細胞也都處于初始狀態。相對于淋巴細胞,單核細胞的比例在10-30%,收到刺激之后會發育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低,只有0.1-0.2%,因此很難從全血樣本中分離到。
一、外周血單個核細胞(PBMC)制備方法
1.設備與試劑
全血 (以10ml為例)
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養基 (Invitrogen)
胎牛血清(FBS)(GIBCO)
雙抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜(DMSO)(SIGMA)
預先裝好異丙醇的凍存盒

2.方法/步驟
配制所需的溶液:
a. 細胞培養基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;
b. 細胞凍存液:FBS中加入10%DMSO;

(1)在離心管中加入淋巴細胞分離液Ficoll
(2)取抗凝外周血(全血)與無菌PBS按照1:1充分混勻,用移液管沿管壁緩慢疊加于分層液面上,動作一定要輕,注意保持清楚的界面。外周血,PBS,淋巴細胞分離液終體積比為1:1:1。
(3)水平離心400g×30分鐘(可根據淋巴細胞分離液Ficoll或離心機轉子要求調整)
(4)離心后可看見管內分為三層,上層為血漿和PBS,下層主要為紅細胞和粒細胞,中層為淋巴細胞分離液。在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶,主要就是單個核細胞,包括淋巴細胞與單核細胞。此外,還含有血小板。
(5)去除部分上層液體,余下約1mL,用移液器插到云霧層,吸取單個核細胞。置入另一離心管中,加入5倍以上體積的PBS,離心300g×10分鐘,洗滌細胞兩次。
(6)末次離心后,棄上清,加入紅細胞裂解液,室溫孵育2分鐘,裂解紅細胞,可根據情況適當增減時間。
(7)加入10mLPBS,離心300g×10分鐘,洗滌細胞兩次。
(8)末次離心后,棄上清,加入含有10%FBS的RPMI1640,重懸細胞,計數,計算細胞活力。

注意事項
全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層,但是終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC離心的時候,一定不能設置低水平的制動。否則將分層混亂。

細胞運輸與保存
(1)干冰運輸,收到細胞后立即轉入液氮凍存或直接復蘇;
(2)T25瓶運輸細胞,收到后應繼續生長,傳代達到細胞生長狀態良好時,再進行凍存,具體操作步驟見細胞培養步驟。

PBMC收到后注意事項:
(1)收到PBMC細胞后首先觀察細胞瓶是否完好,培養液是否有漏液、渾濁等現象,若有上述現象發生請及時反饋。
(2)先不打開瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放培養箱靜置四小時,穩定細胞狀態,切忌在溫箱內靜置過夜。
(3)靜置后鏡檢,拍照,記錄細胞狀態。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。
(4)貼壁細胞:若細胞密度超過80%,可正常傳代;若未超過80%,收集細胞瓶內的培養基,留8ml繼續培養至80%左右再傳代,瓶蓋可稍微擰松。
(5)細胞瓶內的培養基含血清和雙抗,可收集后4℃保存備用,可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內的培養基,一半用自備的培養基,使細胞逐漸適應培養條件,以免因不適應而造成生長狀態不佳。
(6)細胞胰酶消化液建議使用PBS配制。

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不同種屬PBMC:人,猴,犬,大鼠,小鼠

貨號    產品    狀態
0621011/0621012    人外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621021/0621022    猴外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621031/0621032    比格犬外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621041/0621042    大鼠外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621051/0621052    小鼠外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
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